近日，来自澳大利亚昆士兰大学的研究团队在Nature Communications发表了题为“mRNA vaccine quality analysis using RNA sequencing”的研究，建立了一种使用纳米孔测序分析mRNA疫苗和疗法的简化方法——VAX-seq。与行业内其他的标准技术相比，VAX-seq可以全面检测关键的mRNA疫苗质量特征，包括序列、长度、完整性和纯度。研究人员还描述了如何使用RNA测序数据分析mRNA化学，包括核苷修饰的检测，并提供了数据分析软件工具Mana来自动报告mRNA和质粒模板的质量和完整性。

目前，RNA测序技术已经广泛用于细胞基因表达的分析，可以用于检测mRNA的序列同一性和定量丰度。虽然RNA测序可以获得内源性mRNA的特征，但尚未用于mRNA药物的分析和制造。因此，研究团队评估了短读长测序和长读长测序在mRNA疫苗和治疗分析中的应用，并开发了VAX-seq使用纳米孔cDNA测序分析mRNA疫苗。（图1）为了支持VAX测序数据的分析，研究团队还开发了一个软件工具Mana将比对的NGS文库作为输入，并报告质粒和mRNA长度、序列同一性和纯度。

mRNA疫苗和疗法是通过快速、无细胞的体外转录制备的。mRNA制造首先是进行质粒DNA（pDNA）模板的制备和线性化，该模板通过RNA聚合酶在体外转录并合成mRNA，其中通常包含5′ cap 和模板编码的3′poly（A）尾（图1）。随后，还必须纯化mRNA中的污染物，包括反义和双链RNA。这些污染物会引发先天免疫反应，抑制细胞翻译并诱导副作用。

mRNA疫苗制备的第二步，是将线性化质粒作为合成mRNA的体外转录模板，将其从剩余DNA、RNA和蛋白质中纯化出来，并且需要进一步检测以确认序列同一性、长度、完整性。研究人员使用长读长cDNA测序（SQK-PCS111）分析了纯化的mRNA，reads经过处理并与参考质粒序列比对，通过Mana软件进行分析，确定了mRNA的一致序列（consensus sequence）和长度。结果显示，VAX-seq可以检测mRNA疫苗的长度，并对mRNA样本完整性进行定量。对于单个reads，测序平均错误率为5.0%，poly（A）尾部的缺失率较高（13%）（图2a-c）。

据文章介绍，VAX-seq是将逆转录酶引物锚定在poly(A)尾的3’末端，使得完整的poly(A)尾能够被检测其长度（图2d）。但由于缺失误差，长度平均低估了约11.2%（图2d）。这些误差是系统性的，为了校正这些缺失错误，研究人员使用tailfindr软件评估了原始数据，将reads特异性核苷酸易位率归一化。对于eGFP mRNA，预期的126nt相比，tailfindr准确估计poly（A）尾部长度为126.04nt（图2e）。

此外，由于使用了纳米孔测序，VAX-seq可以检测mRNA疫苗的长度，并提供mRNA完整性的定量检测。研究团队通过分析三个重复文库，证明了VAX-序列工作流程测量mRNA完整性的可重复性。以上结果表明，纳米孔测序能够提供任何mRNA疫苗样品在制造、储存或交付过程中的完整性定量分析。

图2. 使用纳米孔测序（PCS111）分析参考eGFP mRNA疫苗。

为了进行比较，研究人员还使用短读长cDNA测序分析了合成mRNA，并使用优化的Mana工作流程分析了文库，短读长测序确认了mRNA序列的一致性和准确性（图3a，b）。但poly（A）尾部的短reads的错位导致了许多错误和较差的一致准确性（consensus accuracy），此外，短读长测序显示覆盖度较差且不均匀，无法对mRNA长度和完整性进行分析。以上结果突出了使用短读长测序分析低复杂性序列的挑战性。

体外转录产生的脱靶RNA可引发先天免疫反应，因此必须将其去除以确保mRNA疫苗的安全性和有效性。研究团队使用VAX-seq分析了cDNA文库中的脱靶RNA的特征，大多数序列（92.7%）与靶mRNA产物比对，只有少数reads（0.01%）被检测到污染，剩余的（7.3%）RNA包含不同的脱靶RNA。(图4e）

纳米孔测序能够直接测序合成的mRNA，在文库制备过程中无需进行逆转录和扩增，并且可以直接分析单个mRNA疫苗分子中的核苷修饰。从直接RNA测序（SQK-RNA002）结果显示，与匹配的cDNA测序文库相比，直接RNA测序文库的产量较低，并且它们目前不能被多路复用，如果在mRNA制造过程中进行大规模测序，应考虑这一点。mRNA疫苗质量分析（poly（A）尾）显示，虽然直接RNA测序提供了足够质量的一致序列，但其平均错误率（7.78%）高于匹配的cDNA测序（图4b）。

详细的分析是开发和制造mRNA疫苗和疗法的关键。VAX-seq能够使用纳米孔cDNA测序分析mRNA疫苗。研究人员设计并制造了参考eGFP mRNA，用于验证VAX-seq方案。eGFP mRNA疫苗包含以下组成部分（按5’至3’的顺序）：（i）用于体外转录的T7 CleanCap启动子，（ii）α-球蛋白5’UTR，（iii）增强型绿色荧光蛋白（eGFP）开放阅读框，（iv）AES-mtRNR1 3’UTR，和（vi）用于模板线性化的限制性酶（BsaI）消化位点（图4e）。

图4. 参考eGFP mRNA疫苗的直接RNA测序。

综上所述，研究团队基于纳米孔测序开发的VAX-seq，能够灵敏、定量地检测关键的mRNA质量特征，包括序列一致性，完整性和污染物。VAX-seq可以在不同的制造步骤检测mRNA的质量，从最初的质粒制备到最终产品的表征，提供单一全面的综合分析。此外，VAX-seq只需要很少的mRNA作为输入，能够支持大批量疫苗批次的大规模验证。